Различия в толерантности металлопротеинов анти- и прооксидантной активности крови крыс после аэробного инкубирования крови с циклофосфамидом (Теоретическая и профилактическая медицина)

Ключевые слова: циклофосфамид, металлопротеины, ткань, крысы (самки, самцы) 

Патофизиологические механизмы действия циклофосфамида (ЦФ) в основном обусловлены продуцированием активных форм кислорода (АФК), которые вызывают геморрагический цистит, нарушение функционирования клеток легких млекопитающих, вызывая воспалительные процессы и оксидативное повреждение, на фоне подавления активности антиоксидантных защитных систем, и повреждения микроструктуры ДНК [11,12,14,18,19], а препараты с антиоксидантной активностью (витамин С, DL-альфа-липоевая кислота, амифостин, мелатонин [10,14,20]) оказывают протективный эффект. ЦФ индуцирует апоптоз COV434 гранулоцитов крови [21]. Действуя такими механизмами, ЦФ в определенных концентрациях  вызывает повреждение опухолевых клеток при бронхиальной карциноме и раке легких [9], с определенным повышением эффективности адаптивной иммунотерапии у мышей [13]. Однако имеются и противоположные данные о том, что ЦФ (циклоспорин, азатиоприн) является препаратом иммуноподавляющей активности [15], вызывая иммунодефицит Т-клеток, путем стимулирования митоза этих клеток [16]. Ключевой системой продуцирования супероксидных радикалов (O₂^–) Т-клетками и другими иммуноактивными клетками (макрофаги, лимфоциты, фагоциты и т.д.) является NАDРН-зависимая O₂^–_-  продуцирующая оксидаза, которая является комбинированным энзимом, состоящим из пяти изоформ цитохрома (цит) b₅₅₈ c молекулярной массой: 40, 47, 67, 22 и 91 кДа [23]. Эти изоформы цитb558 локализованы не только в клеточных формированиях [17,22], но и  в сыворотке крови и эритроцитарных мембранах (ЭМ) млекопитающих [5]. Особое место занимают изоформы цит b₅₅₈ сыворотки крови, которые оказывают высокую резистентность к перекиси водорода [4] и, возможно, играют определенную роль при развитии плода (уровень этих изоформ выше в сыворотке плацентарной крови женщин [5]). С другой стороны, уровень сывороточных цитb558 повышается при злокачественных новообразованиях, особенно в сыворотке крови женщин и в сыворотке крови других млекопитающих (крыса, бык) при аэробном инкубировании крови [1,5]. Предполагается, что изоформы цитb558 сыворотки крови являются экстрацеллюлярными агентами  адаптивной иммунной системы крови [2]. Однако молекулярно-биохимические механизмы непосредственного воздействия ЦФ на течение образования сывороточных цитb₅₅₈ в сыворотке крови и ЭМ крыс (самок и самцов), а также на уровень металлопротеинов антиоксидантной активности (МАА) in vitro еще не определены. 

Целью работы является определение динамики изменения уровней NАDРН-зависимой супероксидпродуцирующей и метгемоглобин (метНb)-восстанавливающей активности [3] изоформ цитb558 ЭМ и сыворотки, а также уровня и активности МАА после четырехдневного аэробного инкубирования крови крыс-самок и самцов в отсутствие и присутствии ЦФ.

Материал и методы

Стабилизированную в оксалатном буфере кровь (по 15 мл)  белых половозрелых крыс-самок и самцов (массой 220-260 г)  инкубировали с ЦФ (по 3,3 мг/мл)  в течение четырех суток, при 4^o в аэробных условиях (это оптимальный срок образования изоформ сывороточных цитb558 in vitro [2]). Выделение эритроцитов осуществлялось путем предварительного промывания физ. раствором осажденных эритроцитов, с дальнейшим отделением плазменных компонентов. Процедуру очистки эритроцитов физ. раствором повторяли дважды [7]. Эритроцитарные мембраны осаждали при pH=6 центрифугированием и промывали калий фосфатным буфером, pH=7.4. Промывание ЭМ продолжали до получения бесцветного супернатанта [8]. Далее осуществляли одновременное и комплексное получение, количественное и качественное определение (определение активности) металлопротеинов прооксидантной активности (МПА) и МАА из этих проб крови (6 серий опытов). 

МАА (Cu,Zn-СОД и каталаза – из цитоплазмы эритроцитов, церулоплазмин и трансферрин – из сыворотки крови) и МПА (суммарная фракция изоформ цитb₅₅₈I + цитb₅₅₈II сыворотки крови, цитb₅₅₈III – из ЭМ, цитb₅ – из цитоплазмы эритроцитов, супероксидпродуцирующий липопротеин сыворотки – супрол) получали универсальным биотехнологическим способом без использования детергента для солюбилизации суммарной фракции цитb₅₅₈ ЭМ. Белковые фракции сыворотки крови, цитоплазмы и ЭМ подвергали ионообменной хроматографии  на целлюлозах КМ-52, ДЕ-52 и сефадексе ДЕАЕ А-50 [7,8].

Количество МАА и МПА определяли оптическим спектральным методом, путем измерения плотности максимального оптического поглощения для изоформ цитb₅₅₈ при 530 нм (бета-полоса поглощения), супрола – 430, церулоплазмина – 610, трансферрина – 470. СОД активность фракций и O^–₂-продуцирующую активность супрола  и суммарной фракции изоформ цитb558 сыворотки крови и цитb₅₅₈III ЭМ  в гомогенной фазе определяли нитротетразолиевым синим  (НТС) путем вычисления процента ингибирования (для СОД) или стимулирования (для супрола или изоформ цитb₅₅₈) образования формазана при 560 нм в результате восстанавления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД активности или O^–₂-продуцирующей активности принимали количество белка, которое подавляет или стимулирует образование формазана  на 50% соответственно. 

МетНb-восстанавливающую активность изоформ цитb₅₅₈  определяли, используя ферригемоглобин (ферриНb) цитоплазмы эритроцитов крыс с величиной плотности максимального оптического поглощения (при 565 нм) 0,8. При этом величина плотности бета-поглощения  (А₅₃₀) изоформ цитb₅₅₈ в реакционной смеси составляла 0,03. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3 мл раствору ферриНb добавляли 0,2 мл изоформ цитb₅₅₈ с А₅₃₀ = 0,4. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16 ч при 30^o. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси, определяли кинетику восстановления ферриHb до ферроHb путем измерения снижения плотности альфа-полосы поглощения ферриHb при 565 нм (это снижение прямо пропорционально образовавшемуся ферроHb, который имеет максимальное поглощение при 555 нм).За единицу ферриНb-восстанавливающей активности изоформ цитb₅₅₈ принимали количество белка, снижающее плотность максимального оптического поглощения ферриНb (при 565 нм) до 0,05 за 1 ч при 30^o. Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим методом, путем вычисления количества расщепленной перекиси водорода в отсутствие и присутствии каталазы. За единицу каталазной активности принимали количество белка, расщепляющее 0,1М перекиси водорода за 1 мин при 20^o.

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре « Specord UV-VIS» (Германия) c длиной оптического пути 1 см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности Р.

Результаты и обсуждение

Четырехдневное аэробное инкубирование крови в отсутствие и присутствии ЦФ вызывает неадекватные изменения уровней и активности МПА и МАА в крови крыс (самок и самцов). ЦФ (3,3 мг/мл) вызывает снижение уровня суммарной фракции сывороточных цитb₅₅₈ I и b₅₅₈ II крови крыс-самцов больше, чем самок. Возможно, этим путем ЦФ оказывает иммуносупрессорный эффект [15]. Такая закономерность наблюдается и у цит b5 из цитоплазмы эритроцитов, а также у цит.b₅₅₈III ЭМ, более того, у самок уровень последнего показателя несколько повышается по сравнению с контролем (показатели в отсутствие ЦФ). ЦФ вызывает снижение и уровня супрола [6] у крыс-самцов, по сравнению  с  показателями  самок (рис.1).  ЦФ  в  приведенных условиях вызывает повышение O₂^–-_- продуцирующей

 Рис. 1. Относительные изменения (%) уровня МПА сыворотки крови и ЭМ у крыс (самок и самцов) после 4-дневной инкубации крови  в аэробных условиях при 4°  с 3.3 мг/мл  ЦФ, по сравнению со 100% контрольными показателями (показатели, полученные в отсутствие ЦФ),   P < 0.05,  n =4

активности супрола крови самок и самцов в одинаковых диапазонах. В аналогичных условиях ЦФ приводит к повышению NАDРН-зависимой O₂^–--продуцирующей и метHb-восстанавливающей активности  изоформ цитb₅₅₈ сыворотки крови самок намного больше, чем у самцов (рис.2). Фактически снижение уровня изоформ сывороточных  цитb₅₅₈ после инкубирования крови с ЦФ вызывает адекватное подавление активности  адаптивной иммунной системы крови крыс-самцов [2]. Однако снижение уровня сывороточных цитb₅₅₈ компенсируется повышением NАDРН-зависимой O₂^–-_-продуцирующей активности этих цитb₅₅₈. Повышение МетНb-восстанавливающей активности изоформ цитb₅₅₈ сыворотки свидетельствует о том, что адаптивная иммунная система крови в условиях

 Рис. 2. Относительные изменения (%) активности антиоксидантных металлопротеинов эритроцитов и cыворотки крови у крыс после 4-дневной инкубации крови в аэробных условиях при 4^o   с 3.3мг/мл ЦФ, по сравнению со 100% контрольными показателями (показатели в отсутствие ЦФ), P ‹ 0.05,  n =4

in vitro может играть определенную роль для обеспечения нормального протекания кислородного гомеостаза при действии ЦФ, путем стимулирования образования ферроНb (оксиHb), который способен перенести молекулярный кислород к клеткам. Эта закономерность не сохраняется у цитb₅₅₈III ЭМ. По сравнению со 100% показателями крыс-самцов, инкубирование  крови  самок в приведенных условиях вызывает снижение NАDРН-зависимой O₂^–--продуцирующей активности цитb₅₅₈III, особенно в присутствии ЦФ. Однако в этих условиях метНb-восстанавливающая активность цитb₅₅₈III ЭМ у крыс-самок несколько выше, чем у самцов, хотя под влиянием ЦФ происходит заметное снижение этой активности (рис.2). 

Таким образом, в результате аэробного инкубирования крови крыс с ЦФ  в приведенных условиях прооксидантная толерантность сыворотки крови (изменение уровня, NАDРН-зависимой супероксид-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности  изоформ цитb₅₅₈ сыворотки крови, а также супрола под влиянием ЦФ) крыс-самок повышает таковую у крыс-самцов. Однако прооксидантная толерантность ЭМ (изменение уровня, NАDРН-зависимой супероксид-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности цит b₅₅₈III ЭМ, а также уровня цит b₅ под влиянием ЦФ) меньше у крыс-самок, по сравнению с этими показателями у самцов. Это свидетельствует о том, что стабильность эритроцитов самок уступает таковой у самцов после аэробного инкубирования крови с ЦФ. 

Четырехдневное аэробное инкубирование ЦФ с кровью крыс-самок и самцов  приводит к неадекватным снижениям уровня и активности МАА. Активность Cu,Zn,СОД в цитоплазме эритроцитов самцов  и самок снижается почти в одинаковых диапазонах, однако каталазная активность у самок снижается больше. На этом фоне снижение уровня трансферрина у самок еще заметнее. В этих условиях снижение уровня церулоплазмина сыворотки крови самок  превышает таковое у самцов (рис.3).         

Рис. 3.  Относительные изменения (%) O₂^–--продуцирующей активности супрола (А), метHb-восстанавливающей (Б) и NADРH-зависимой O₂^–-продуцирующей (В)  активности суммарной фракции изоформ цит b₅₅₈I + цит b₅₅₈II сыворотки крови, NADPH -зависимой O₂^–- -продуцирующей (Г) и метНb-восстанавливающей (Д)  активности цит b₅₅₈III ЭМ крыс-самок, по сравнению со 100 %  показателями  крыс-самцов в отсутствие (1) и присутствии (2) ЦФ, P ‹ 0.05,  n=4  

Можно заключить, что в результате четырехдневного аэробного инкубирования крови крыс-самок и самцов  с ЦФ при 4^o прооксидантная толерантность сыворотки  крови самок повышает таковую у крыс-самцов. Однако прооксидантная толерантность ЭМ меньше у самок, по сравнению с этими показателями у крыс-самцов. Это свидетельствует о том, что стабильность эритроцитов крыс-самок уступает таковой у самцов после аэробного инкубирования крови с ЦФ. С другой стороны, антиоксидантная толерантность крови (изменение уровня и активности МАА крови под влиянием ЦФ) самок  в большинстве случаев ниже, чем  у крыс-самцов. В этом аспекте при определении механизмов оксидативного повреждения крови млекопитающих необходимо учитывать пол экспериментальных животных.        

Литература

1. Симонян Г.М. Цитохром b558 из сыворотки венозной крови человека и дисбаланс между уровнями металлопротеинов с острым лимфобластическим и миелобластическим лейкозом. Мед.наука Армении НАН РА,2002,т.XLII, 2, с.101-103.
2. Симонян Г.А., Симонян Р.М., Симонян М.А. Образование сывороточных цитохромов b558 в результате инкубирования крови in vitro. Мед.наука Армении НАН РА, 2005, т.XLV, 2, с.26-29.
3. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А., Галоян А.А. Влияние обогaщенного пролином полипептида на восстановление метгемоглобина и образования супероксида под влиянием цитохрома b558III и супрола in vitro. Нейрохимия, 2007, т.24, 1, с.37-40.
4. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Высокая резистентность сывороточных цитохромов b558I и b558II против перекиси водорода по сравнению с другими гемопротеинами. В кн.:Актуальные вопросы военной медицины. Сборник докладов научной конференции ЕрГМУ им.М.Гераци. Ереван, 1999, с.48-51.
5. Симонян М.А., Бабаян М.А., Симонян Г.М. Цитохромы b558 из сыворотки крови и мембран эритроцитов. Выделение, очистка, краткие характеристики. Биохимия, 1995, т.60,  2, с.1977-1987.
6. Симонян М.А., Карапетян А.В., Бабаян М.А., Симонян Р.М. NАDРН содержащая, супероксидпродуцирующая липопротеиновая фракция из сыворотки крови. Выделение, очистка, краткая характеристика и механизм действия. Биохимия, 1996, т.61, 5, с.932-938. 
7. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения металлопротеинов. Лицензия изобр. N 341 Армпатента, Ереван, 1997.
8. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобр.N 908 Армпатента, Ереван, 2001.
9. Colvin O.M. An overview of cyclophosphamide development and clinical applications. Curr.Pharm.Des., 1999, Vol. 5, 8, p.555-560.
10. Elangovan S., Chidambaram P., Yenjerla M., Palaminathan V. Protective effect of DL-alfa-lipoic acid in cyclophosphamide induced oxidative injury in rat testis. Reproductive Toxicol., 2004, Vol. 19, 2, p.163-167.
11. Jawaharlal M.P., Edward R.B. Cyclophosphamide-induced depression of the lung. Pulmonary Med., 1985, Vol. 8, 2, p.153-165.
12. Korkmaz A., Topal T., Oter S. Pathophysiological aspects of cyclophosphamide and ifosfamide induced hemmorhagic cystitis, implification of reactive oxygen and nitrogen species as well as PARP activation. Cell Biol.Toxicol., 2007, Vol. 23, 5, p.303-312.
13. Proietti E., Greco G., Garrone B. et.al. Importance of cyclophosphamide–induced bystander effect on T-cells for a successful tumor eradication in response to adaptive immunotherapy in mice. J.Clim.Invest., 1998, Vol.101, 2, p.429-441.
14. Rech Franke S.I., Pra D., Da Silva J. et al. Possible repair action of vitamin C on DNA damage induced by methyl methanesulfonate, cyclophosphamide, FeSO4 and CuSO4 in mouse blood cells in vivo. Mutant.Res.Genetic Toxicol. Environment.Mutagenesis, 2005, Vol.583, 1, p.75-84.
15. Schellekens P.T., Ten Berge R.J. The effects of immunosuppressive drugs on human immunocompetence. Pharm.Weekble.Sci., 1984, Vol.6, 1, p.32-38.
16. Shimizu M., Sabolovic D., Ozawa H., Iwaguchi T. Cyclophosphamide-induced suppressor cells in nude mice. Anticancer Drugs, 1992, Vol.3, 4, p.427-433.
17. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Stimulation of the NADPH depending superoxide-producing and methemoglobin-reducing activities of new isoforms of cytochrome b558 by PRP-1 and GxNH2. Neurochem.Res., 2008, Vol.33, p.1155-1156.
18. Stankiewicz A., Skrzydlewska E., Makiela A. Effects of amifostine on liver oxidative stress caused by cyclophosphamide administration to rats. Drug  metabolism and drug interactions, 2002, Vol.19, 2, p.67-82.
19. Sulkowska M., Sulkowski S., Skrzydlewska E. et al. Cyclophosphamide-induced generation of ROS. Comparison with morphological changes in tipe II alveolar epithelial cells and lung capillaries. Exp.Toxicol.Pathol., 1998, Vol.50, 3, p.209-220.
20. Topal T., Oztas Y., Korkmaz A. et al. Melatonin ameliorates bladder damage induced by cyclophosphamide in rats. J.Pineal Res., 2005, Vol.38, 4,p.272-277.
21. Tsai-Turton M., Luong B.T., Youming T., Luderer U. Cyclophosphamide-induced apoptosis in COV434 human granulose cells involves oxidative stress and glutathione depletion. Toxicol.Sci., 2007, Vol.98, 1, p.216-230.
22. Ushio-Fukai M. Localizing NADPH oxidase-derived ROS. SciSTKE.2006Aug 22; 2006(349):re8
23. Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanisms. Cell Mol.Sci., 2002, Vol.59, 9, p.1428-1459.  

Вопросы, ответы, комментарии