Влияние соединения 2-циан -3,4,4-триметил-2-бутен-4-олида на эндогенный уровень металлопротеинов и малонового диальдегида в печени крыс на начальной стадии развития саркомы-45

Ключевые слова: 2-циан-3,4,4-триметил-2-бутен-4-олид , саркома-45, малоновый диальдегид, металлопротеины, печень 

Активные формы кислорода (АФК) являются ключевыми факторами развития злокачественных новообразований (метастаз) [14,19]. Основными источниками продуцирования АФК являются НАДРН-оксидазы, локализованные в первую очередь в мембранах клеток иммунной системы [18], причем продуцирование АФК в большинстве случаев увеличивается при канцерогенезе [9,12]. Однако АФК при накоплении вызывают оксидативное повреждение ДНК опухолевых клеток, подавляют их рост и вызывают апоптоз последних [8,11,13]. При саркоме-45 (С-45) и саркоме Эрлиха эти изменения ассоциируются с отклонением антиоксидантного и прооксидантного статуса крови и печени, функционированием митохондрий, метаболизмом NO., ингибированием антиоксидантной системы, снижением стабильности эритроцитов и повышением степени анемии [10]. Соединения (интерферон-бета, ретиноевая, кофеиновая и фериликовая кислота), стимулирующие НАДРН-оксидазы, вызывают апоптоз и снижение прогрессирования опухолевых клеток [7]. Фактически и снижение, и повышение  физиологического уровня АФК (супероксидных радикалов) отрицательно влияют на состояние опухолевых клеток. С этой точки зрения определенный интерес представляет выявление молекулярно-биохимических механизмов воздействия 2-циан-3,4,4-триметил-2-бутен-4-олид (ЦТБО) – соединения, обладающего СОД-миметической активностью при канцерогенезе.

Целью работы является  определение характерных изменений эндогенного уровня и активности металлопротеинов прооксидантной активности (МПА) и металлопротеинов антиоксидантной активности (МАА), а также продукта липидной пероксидации – малонового диальдегида (МДА) в печеночной ткани белых крыс на начальных этапах развитии С-45 под влиянием экзогенно введенного ЦТБО.

Материал и методы

Белые беспородные крысы-самцы массой 160-180 г., содержащиеся на полноценном режиме в течение месяца до начала эксперимента, были разделены на три группы (по 12 в каждой). Ткань С-45 (5г) размельчали специальной установкой, не повреждая клетки в 20 мл физиологического раствора. Животным первой опытной группы (ОГ-1) подкожно вводили по 1 мл этой смеси опухолевых клеток. Животным ОГ-2 вводили клетки С-45 и через 3 дня в том же объеме вводили внутрибрюшинно 17 мг/кг ЦТБО каждый день в течение 8 дней. Контрольным животным вместо ЦТБО вводили физраствор в аналогичном режиме. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом на 15-й день опыта. Печень животных подвергали перфузии физраствором и гомогенизировали в 0,04 М калий фосфатном буфере, рН 7,4 (КФБ). Гомогенизацию печени (10 г) проводили в 40 мл КФБ. По 3 мл из этого гомогената отделяли для определения количества МДА оптическим спектральным методом [1]. МАА (Cu,Zn-СОД, Мn-СОД и каталаза) и МПА (фракция новой изоформы цитохрома b558, цитохрома С) получали из печени и количественно определяли биотехнологическим способом без использования детергента, который отрицательно влияет на эти металлопротеины (МП) [3,5], используя вместо крови и эритроцитарных мембран гомогенат  и мембраны клеток печени (МКП). Белковые фракции гомогената и МКП после диализа и удаления нерастворимых остатков подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52 и ДЕ-52 (Whatman, Англия ). 

Количество полученных МП определяли на основании оптических плотностей : для цитохрома (цит) С при 520 нм, фракции цит b558 – 530 нм. СОД-активность фракций и НАДРН-зависимую супероксид (О2-) -продуцирующую активность фракции цит b558 в гомогенной  и  гетерогенной фазах (в МКП) определяли нитротетразолиевым синим методом [2].

Метгемоглобин (метНb)-восстанавливающую активность фракции цит b558 МКП в гомогенной фазе определяли оптическим спектральным методом, путем вычисления процента снижения плотности максимального оптического поглощения при 565 нм  метНb крыс (А₅₆₅ в реакционной смеси составляло 0,8) в присутствии фракции цит b558 (А₅₃₀ в реакционной смеси составляло 0,03). Для определения метНb-восстанавливающей активности фракции цит b558 в гетерогенной фазе (в МКП) к 3 мл реакционной смеси добавляли 0,2 мл МКП с 0,04 М КФБ [16].

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора перекиси водорода в отсутствие и присутствии каталазной фракции.

Гомогенизацию печеночной ткани проводили на размельчителе тканей со скоростью вращения ножей 3000 об/мин в течение 3 мин при 4о. Оптические спектральные измерения проводили на спектрофотометре “Specord M-40” (Германия) с длиной оптического пути 1 см. Ститистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности (Р).

Результаты и обсуждение

На начальных стадиях развития С-45 в течение 15 дней в ОГ-1 и ОГ-2 гибель животных не наблюдалась. Средняя масса опухолей в ОГ-1 составила 1,2± 0,1г, в ОГ-2  – 0,9±0,1 г (P,‹0,05). При этом подкожная распространенность опухолевых очагов в ОГ-1 превышала аналогичную в ОГ-2 в 1,9 раза. Следовательно, противоопухолевое действие ЦТБО заключается в предотвращении распространенности опухоли и подавлении его роста (40,04,3%, Р‹0,03). 

В ОГ-1 наблюдается увеличение эндогенного уровня фракции цит b558 [4]. Это ассоциируется с увеличением НАДРН-зависимой О2- -продуцирующей активности  цит b558 МКП в гомогенной и гетерогенной фазах. Однако в ОГ-1 метНb-восстанавливающая активность  цит b558 снижается, особенно в гетерогенной фазе. Это свидетельствует о том, что цит b558 МКП претерпевает качественное изменение. Снижение метНb-восстанавливающей активности цит b558 МКП может отрицательно влиять на кислородный гомеостаз, ассоциированный с повышением степени анемии, что является новым механизмом индуцирования анемии при канцерогенезе [2]. Однако увеличение НАДРН-зависимой О2- -продуцирующей активности фракции цит b558 МКП, с одной стороны, может вызывать стимулирование иммунной системы, для которой НАДРН-оксидаза является основным источником продуцирования О₂^--  (цит b558 является ключевым компонентом этой комбинированной оксидазы) [18], с другой – увеличение уровня О₂^- - (соответственно перекиси водорода и гидроксильных радикалов) может вызывать оксидативное повреждение окружающих биосистем [6].

Снижение уровня цит С в клетках (митохондриях)  печени крыс при С-45 (ОГ-1) свидетельствует об ослаблении процессов дыхательной цепи митохондрий, однако это компенсируется некоторым увеличением уровня цит b558 в клетках печени. С другой стороны, увеличение уровня МДА в печени в ОГ-1 может быть связано с повышением уровня О₂^-- продуцируемых цит b558 (О₂^- и НО. стимулируют перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов биомембран) [6]. При участии  цит b558 стимулируется  продуцирование О₂^- и перекиси водорода в митохондриях печени [17], а эти АФК являются потенциальными канцерогенными агентами, путем повреждения ДНК [18]. АФК отрицательно действуют и на МАА [15], что выражается снижением активности этих МП в клетках почек  в ОГ-1 (таблица). 

Таблица

 Относительное изменение  (%) уровня и активности про- и антиоксидантных МП и МДА в печени крыс при С-45  под влиянием ЦТБО в лечебном режиме, по сравнению с 100% контрольными показателями (Р‹0,05, n =8)

Экзогенно введенный ЦТБО (в приведенной более эффективной концентрации) оказывает положительный регулирующий эффект на МАА и МПА (таблица), видимо, путем улавливания О2-. Это в свою очередь снижает степень оксидативного повреждения клеток печени,  несколько стимулирует кислородный гомеостаз и снижает степень анемии. Эти изменения так или иначе повышают резистентность организма к оксидативному стрессу при канцерогенезе.

Можно заключить, что экзогенно введенный ЦТБО в лечебном режиме играет антистрессорную, антиканцерогенную роль на начальных этапах развития С-45. Это дает основание для дальнейшего определения влияния ЦТБО на аналогичные показатели крови при С-45 и   предложения его для предклинического испытания.

Литература

1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление в биологических мембранах. М., 1972.
2. Симонян Г.М. Автореф.канд.дис. “Оксидативный стресс при злокачественных новообразованиях”.  Ереван, 2003. 
3. Симонян Г.М., Симонян М.А., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобретения N908 Армпатента. Ереван, 2001.
4. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Галоян А.А., Симонян М.А. БПП-1 стимулирует метНb-восстанавливающую и понижает НАДРН-зависимую активность новых изоформ цитохрома b558 в мембранах эритроцитов, тимуса, костном мозге и селезенке. Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии. III международный симпозиум под эдигой ЮНЕСКО. Москва, Дубна, 2007, с.64-65.
5. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения металлопротеинов. Лицензия изобретения N341 Армпатента. Ереван, 1997.
6. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutase, Ann. Rev.Biochem., 1995, 64, p.97-112.
7. Huang G., Chen Y., Lu H., Cao X. Coupling mitochondrial respiratory chain to cell death: an essential role of mitochondrial complex I in the interferon-beta and retinoic acid-induced  cancer  cell  death, Cell.  Death  Differ., 2007, 14,    p.327-337.
8. Kawanishi S., Inoue S. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species, Seikagaku , 1997, 68, p. 1014-1017.
9. Kim H.J., Oridate N., Lotan R. Increased level of the p47-phox subunit of NADPH oxidase by NADPH in head and neck  squamous  carcinoma  cells,  Int. J.Oncol., 2005, 27,  p.787-790.
10. Kipiani V.A., Gambashidze K.G. et al. Changes in the pro-oxidant and anti-oxidant status of tissue during paraneoplastic processes, Bull.Exp.Biol.Med., 2000, 141, p.23-25.
11. Lee Y.S. Role of NADPH-oxidase-mediated generation of ROS in the mechanism of apoptosis induced by phenolic acids in Hep G2 human hepatoma cells, Arch.Pharm.Res., 2005, 28, p.1183-1189.
12. Maltseva V.G. Dynamic analysis of modification of peripheral neutrophils functional activity and its regulation during tumor growth in vivo, Tsitologiia, 2006, 48, p.1000-1009.
13. Moto M., Umemura T., Okamura M. et al. Possible involvement of oxidative stress in dicyclonic-induced hepatocarcinogenesis in mice, Arch.Toxicol., 206, 80, p.694-702.
14. Paradiuk S., Renke J., Wozniak M., Korzon M. Does chemotherapy and radiotherapy influence the level of oxidative stress in children with malignant bone tumours? Med.Wieku.Rozwo J., 2006, 10, p.855-859.
15. Rohrdanz E., Kohl R. Relation of antioxidant enzyme expression is response to hydrogen peroxide, Free Radic. Biol. Med., 1998, 24, p.27-38.
16. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. The reduction of ferrihemoglobin by erythrocytes membranes cytochrome b558III at various pathological states in vitro, Electronic J. of Natural Sciences NAS RA, 2006, 2, p.3-6.
17. Sohal R.S. Mitochondria generate O2- and H2O2, FASEB J., 1997, 11, p.1269-1270.
18. Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism, Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59, p.1428-1459.
19. Wu W.S. The signaling mechanism of reactive oxygen species in tumor progression,  Cancer  Metastasis  Rev.,  2006, 25,   p.695-705. 

Вопросы, ответы, комментарии